堿性磷酸酶的分離提取及比活力的測定

一、實(shí)驗(yàn)原理

       堿性磷酸酶（alkaline phosphatase   EC 3.1.3.1簡稱為ALPase）廣泛存于微生物界和動(dòng)物界。ALPase能催化幾乎所有的磷酸單酯的水解反應(yīng)，產(chǎn)生無機(jī)磷酸和相應(yīng)的醇、酚或糖。它也可以催化磷酸基團(tuán)的轉(zhuǎn)移反應(yīng)，磷酸基團(tuán)從磷酸酯轉(zhuǎn)移到醇、酚或糖等磷酸受體上。在磷的生物和化學(xué)循環(huán)過程中，ALPase起了及其重要的作用。在生物體內(nèi)ALPase與磷的代謝直接相關(guān)，參與磷與鈣物質(zhì)的消化、吸收、分泌以及骨骼的形成等生理生化過程。ALPase的作用zui適PH在堿性區(qū)域，一般在PH9.0~10.5范圍內(nèi)。Mg2+對該酶的活力有顯著的激活使用。

       為了獲得好的提取效果，在酶的制備過程，特別應(yīng)注意以下幾點(diǎn)：

       1.選取來源豐富、酶含量高的新鮮材料。提取工作應(yīng)在獲得材料后立刻開始，否則應(yīng)在低溫下保存。

       2.用鹽分級沉淀是一種應(yīng)用非常廣泛的方法。碳酸銨是zui常用的鹽。操作時(shí)，要注意保持緩沖液的合適PH值和溫度。在加碳酸銨時(shí)需事先將其研細(xì)，需緩慢加入并及時(shí)攪拌溶解，盡量防止泡沫形成，以免酶蛋白在溶液中表面變性。鹽析生成的沉淀，要靜置20min以上，以使沉淀*，然后方可時(shí)行離心分離。

      3.有機(jī)溶劑沉淀法也常用于蛋白質(zhì)的分離提純。丙酮和乙醇是使用的兩種有機(jī)溶劑。應(yīng)注意在低溫下操作，緩慢加入，充分?jǐn)嚢瑁苊饩植繚舛冗^高放出大量熱量而使酶蛋白變性。離心收集沉淀后，立即將其溶于適量緩沖液中，以避免酶活力的喪失。

       4.在酶的制備過程中，每經(jīng)一步處理，都需測定酶的活力和比活力。唯有比活力提高較大，提純步聚才有效。

        酶活力的分析：通常是以對—硝基苯磷酸二納（pNPP)為底物，在PH10.1的碳酸鹽緩沖液（含2mmol/L Mg2+）的測活體系中檢測酶催化pNPP水解產(chǎn)生黃色的對硝基苯（ pNP）在405 nm處有zui大的吸收峰，可以根據(jù)OD4〇5值的增加計(jì)算酶活力的大小。酶活力定義為在37℃下，以5mmol/L pNPP為底物，在pH 10.1的碳酸鹽緩沖液含2 mmol/L  Mg2+的測活體系中每分鐘催化產(chǎn)生1 mol/L pNP的酶量定為1個(gè)酶活力單位。酶的比活力定義為每mg蛋白所具有的酶活力單位數(shù)。 

       蛋白質(zhì)濃度的測定常采用福林-酚試劑(Folin-Phenolreagem)顯色法。

二、實(shí)驗(yàn)用品

(一)器材

    (1) 髙速組織搗粹機(jī)和玻璃勻漿器。

    (2) 離心機(jī)。

    (3) 超級恒溫水浴鍋。

    (4) 酸度計(jì)。

    (5) 722分光光度計(jì)。

    (6)天平、臺(tái)秤。

    (7)透析袋。

    (8)磁力攪拌器。

    (9)冰箱。

    (10)秒表。

    (11)50µL微量進(jìn)樣器。

  （二）試劑

     (1)含0.1mol/L NaCl 的0.01mol/L Tris.HCL PH7.5緩沖液：稱取三羥甲基氨基甲烷1.214g，NaCl5.8g，溶于蒸餾水中，加入80ml 0.1mol/L HCL，用蒸餾水定容到1000ml。

     (2)正丁醇（分析純）。

     (3) 硫酸銨(分析純)。

     (4) 0.5% NaCl：稱取 5 g NaCl 溶于1000 mL蒸餾水中。

     (5) 0.1 mol/L Na2C〇3-NaHC〇3  pH 10.1 緩沖液:分別取(A)液 70mL，（B)液30ml混勻，用酸度計(jì)準(zhǔn)確調(diào)節(jié)pH 10.1。

           (A) 0.1 mol/L Na2C〇3溶液：取 28.6 g Na2C〇3.10H20溶于1000 mL蒸餾水中 。    

           (B) 0.1 mol/L NaHC〇3 溶液：取 8.4 g NaHC〇3 溶于1000 mL蒸餾水中。

     (6) 0.5 mol/L醋酸鎂溶液：稱取醋酸鎂107.25 g溶于蒸餾水中，稀釋成1000ml。

     (7) 0.1 mol/L醋酸鈉溶液：稱取醋酸鈉8.2 g溶于蒸餾水中,稀釋至1000 ml。

     (8) 0.01 mol/L醋酸鎂-0.01 mol/L醋酸鈉溶液：取0.5 mol/L醋酸鎂20ml醋酸鈉100 mL，混勻后加蒸餾水稀釋至1000 mL。 

      (9) PH8.8 Tris.HCl緩沖液：稱取三羥甲基氨基甲烷(Tris)12.1 g，用蒸餾水溶解。并稀釋至1000ml，即為0.1 mol/L Tris溶液。取0.1 mol/L Tris 溶液100mL，加蒸餾水約800ml，再加0.1 mol/L醋酸鎂100 mL，混勻后用1 %醋酸調(diào)節(jié)pH至8.8,用蒸餾水稀釋至1000ml即可。

    (10) 丙酮(分析純)。

    (11) 95%乙醇(分析純)。

    (12) 20 mmol/L Mgcl2：稱取 1.904 g Mgcl2溶于1000ml蒸餾水中。 

    (13) 0.1 mol/L NaOH：稱取 4 g NaOH 溶于1000ml蒸餾水中。 

    (14)  20 mmol/L 對硝基苯磷酸二鈉（pNPP):稱取371.2 mg pNPP溶于50ml蒸餾水中。

    (15) 底物溶液(5mmol/L pNPP)：按以下比例混句(5):(6):(8):H2O=l:0.2：0.50:.28。 

    (16)0.5µmol/mL對硝基苯酚（pNP=141.1)溶液:稱取17.64mg對硝基苯酚，用蒸餾水溶解并定容至250 mL。

    (17) Folin甲。

    (18) Folin乙 。

    (三)材料

          (1) 新鮮牡蠣。 

          (2) 新鮮兔肝。

三、實(shí)驗(yàn)程序

  （一）操作方法

     1.牡蠣堿性磷酸酶的分離提取

   (1)稱取100g牡蠣（蒸餾水洗凈），加入150預(yù)先冷卻的0.01mol/L Tris.HCL 緩沖液（PH7.5，含0.1mol/L NaCl），于高速組織搗碎機(jī)勻漿1min，量勻漿體積，于冰箱4℃放置3h進(jìn)行抽取。（留勻漿液10ml，采用離心或過濾，得到上清液，待測酶的比活力）

   (2)緩慢加入20%（V/V）冰冷的正丁醇，邊加邊攪拌均勻。冰箱放置2~3h。

   (3)室溫離心，4000r/min 30min，收集離心上清液，并量體積。。（留5ml上清液，對含0.1mol/L NaCl的0.01mol/L Tris.HCL 緩沖液PH7.5透析平衡，待測酶的比活力。）

   (4)在正丁醇處理的上清液中加入研磨細(xì)粉的固體硫酸銨至0.35飽和度（100ml加入20.9g）。緩慢加人，不斷攪拌溶解，置冰箱靜置4 h。

   (5) 室溫離心，4 000 r/min 30 min，收集離心上清液，并量體積。（留5ml上清液，對0.01mol/L Tris.HCL 緩沖液PH7.5含0.1 mol/L NaCl透析平衡，待測酶的比活力）。

   (6) 0.35 mol/L飽和硫酸銨上清液，加入固體研磨細(xì)粉的硫酸銨至 0.70飽和度（100ml加入23.8g）。緩慢加入，不斷攪拌溶解，置冰箱靜置4 h。

   (7) 室溫離心，4 000 r/min 30 min,收集沉淀物。（沉淀蛋白上浮，先把下面清液虹吸出來，余少量清液連同沉淀一起離心）

   (8) 得到沉淀物，溶于20mL 含 0.1 mol/LNaCl 的 0.01mol/L ris.HCL 緩沖液PH7.5。裝入透析袋，先對預(yù)冷的0.5% NaCl透析(常換透析液），至無S〇4-2被檢測出為止（可用一定濃度BaCl2溶液檢驗(yàn))。再對0.01 mol/L Tris . HCl pH7.5緩沖液透析平衡。 

   (9) 取出酶溶液，冷凍高速離心(0℃： 25 000 r/min 30 min)。

   (10) 離心上清液即為粗酶制劑，檢測酶的比活力。裝人棕色瓶于4℃冰箱保存。

 2.兔肝堿性磷酸酶的分離提取 

   (1) 取2 g新鮮免肝剪碎后，置于玻璃勻漿管中，加入0.01 mol/L醋酸鎂，0.01 mol/L醋酸鈉 6ml，研磨2?3 min。將勻漿倒入刻度離心管中，記錄其體積。吸出0.1ml置于另一試管中，在此試管中加4.9ml PH8.8 Tris . HCl緩沖液稀釋，待測比活力。

    (2) 加2 ml正丁醇于勻漿中，用玻璃棒充分?jǐn)嚢? min左右，然后在室溫中旋轉(zhuǎn)20min。用濾紙過濾，濾液置于刻度離心管中。

    (3) 濾液中加入等體積的冷丙酮，立即混勻后離心（2 000 r/min)5min，棄去上清液。在沉淀中加入0. 5 mol/L醋酸鎂4 mL，用玻璃充分?jǐn)嚢枋蛊淙芙?，記錄溶液體積。吸取0.1ml。置于另一試管中，在此試管中加入PH8.8 Tris . HCl緩沖液4.9ml，待測比活力。

   (4) 在溶液中緩慢加人冷95%乙醇，使乙醇zui終濃度達(dá)30%，混勻后離心（2000r/min）5min， 將上清液倒人另一離心管中，棄去沉淀。上清液中加人冷95%乙醇，使乙醇zui終濃度高達(dá)60%，混勻后離心(2 500 r/min)5 min，棄去上清液，沉淀中加人0.5 mol/L醋酸鎂3ml，使其充分溶解，并記錄體積。吸取0.2 mL置于另一試管中，加入pH8.8 Tris . HCl緩沖液3.8ml，待測比活力。

  (5) 上述溶液中逐漸滴加人冷丙酮。使丙酮zui終濃度達(dá)33%?；靹蚝箅x心（2000 r/min)5 min，棄去沉淀,上清液則在另一刻度離心管中再緩慢加入冷丙酮。使丙酮zui終濃度達(dá)50%?；靹蚝箅x心（(4000 r/min)10 min,，棄去上清液，沉淀即為部份純化的堿性磷酸酶。此沉淀中加入pH8.8 Tris . HCl緩沖液4ml使其溶解，并記錄體積，吸取0. 5 mL置于另一試管中，加入pH8.8 Tris . HCl緩沖液2 mL稀釋，待測比活力。

 3.比活力測定 

   (1)對硝基苯酚標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作：取15支試管編號，0號一支，1~7號各二支，按表10-1操作：

以對硝基苯酚的量（µmol/L）為橫坐標(biāo)，OD405值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。示出pNP的克分子消光系數(shù)（ε）值。

 (2) 酶活力的測定:

      取干凈的試管21支，編號,0號一支作為空白對照，以緩沖液代替酶液;1~4號各3支，作為各步的酶樣測定;1'?4'各2支，作為相應(yīng)的樣品對照;各管加入1.98ml底物溶液（試劑9）,于37℃恒溫水浴中預(yù)熱5 min, 1?4號管分別加人各步酶樣20µl，反應(yīng)10min，各管加入2 mL 0.1 mol/L NaOH終止反應(yīng)并顯色，0號加入20µl Tris . HCl緩沖液代替酶液，1'?4'管先加入NaOH后再分別補(bǔ)加對應(yīng)的酶液20 µl 。以0號管調(diào)零點(diǎn)，于722分光光度計(jì)測定各管的OD405值，各個(gè)測定管的平均OD值減去對照管的平均OD值，從對照標(biāo)準(zhǔn)曲線求出產(chǎn)物的µmol數(shù)，算出酶活力。

（3）蛋白濃度的測定:

      上述分離提取的四步酶制劑按一定比例用Tris . HCl緩沖液稀釋，稀釋倍數(shù)視溶液的蛋白濃度高低而定，以1步驟所提的堿性磷酸酶為例，一般*步和第四步稀釋40?50倍，第二步稀釋5?10倍。第三步稀釋2?5倍。 

取千凈的試管13支，編號，0號一支作為空白試驗(yàn)，加入0.5 mLTris . HCl緩沖液稀釋PH7.5；1~4號管各3支，作為各步的酶樣測定，各管加人相應(yīng)的已稀釋的酶液0.5 mL;各管加入Folin-酚試劑甲 4 mL，室溫放置10 min，再加入Folin-酚試劑乙0.5 mL，混勻，放置30 min。以0號管調(diào)零點(diǎn)，于 722分光光度計(jì)測定各管的OD650值，從對照標(biāo)準(zhǔn)曲線求出各樣品的蛋白濃度。

 4.結(jié)果處理 

  計(jì)算：

式中：為透析后的體積變化系數(shù)；B為稀釋倍數(shù)，C為由標(biāo)準(zhǔn)曲線査得的pNP（mol/L），t為反應(yīng)時(shí)間，D為由標(biāo)準(zhǔn)曲線査得的蛋白的質(zhì)量(mg)，V1為測定酶活力所用的酶量（ml）。